马蹄莲属(Zantedeschia)花卉是当前新兴的球根花卉之一，属天南星科(Araceae)，又以其中的彩色马蹄莲在切花、盆花及庭院美化市场中占有重要地位。彩色马蹄莲是本属中除白花马蹄莲(Z. aethiopica)外其它种及杂交品种的统称，原产非洲中南部，有黄、橙、粉、粉红、红和复色等(Funnell, 1993)，在欧美各国及日本等地广受欢迎。彩色马蹄莲自20世纪80年代进入中国市场，因其奇特的花型和丰富的色彩，逐渐成为我国重要的切花、盆花产品，具有较大的发展潜力(张永春等, 2009)。

在彩色马蹄莲的生长过程中，植株成花的启动和增加花芽数量等都需要激素处理(常用赤霉素GA3)来完成，国内外对激素与打破休眠、促进开花及增加花芽数量等方面的影响开展了很多试验(房伟民等, 2002; Corr and Widmer, 1987; Naor et al., 2005a; 2005b; Treder, 2005)，但对于其深层次的原因尚缺少系统研究，特别是成花启动基因的研究还未见报道。另外，彩色马蹄莲从组培种苗到开花需要经过2~3个生长期才能实现，如何缩短这一过程具有很重要的生产价值。这些都涉及到花发育的启动和花器官的形成。植物花芽分化是经过一定阶段的营养生长，叶芽生理和组织状态转化为花芽生理和组织状态，发育成花器官雏形(马月萍和戴思兰, 2003)，而花器官的发育由器官特性基因决定,这些基因的精确表达需要花分生组织特性基因的激活和多个正、负调节因子的调控(张云和刘青林, 2003)。

本研究期望选用mRNA差异显示技术，通过分析叶芽与花芽的基因差异表达，探索影响花芽形成的关键基因，从分子水平了解成花启动和花发育的机理。

mRNA差异显示技术(mRNA differential disp1ay, DDRT-PCR)是通过mRNA反转录与PCR技术相结合，进而形成差异RNA指纹图谱的技术(Lievens et al., 2001)。由于不同组织细胞或相同组织细胞有不同的处理，都有产生特异表达的基因谱带，从而可利用这一技术分离和鉴定具有特异性表达的基因(刘凯等, 2009)，为寻找未知基因开辟了一条高效途径，已在生物技术多个领域得到广泛应用(De Groot et al., 1999; Liang and Pardee, 1992; Moore et al., 2003; Sun et al., 2004; Li et al., 1994; Thorne and Paul, 2003; 季哲等, 2007; 周明芹等, 2008)，涉及基因诱导表达、发育分子机理、杂种优势等方面的研究，已成功分离到多种基因(刘凯等, 2009)。

本研究期望建立一种彩色马蹄莲叶芽和花芽的mRNA差异显示技术，用以探索影响成花的特异基因，为深入研究彩色马蹄莲的成花基因提供一条技术路径

1结果与分析
1.1 RNA提取与质量分析
本研究采用Trizol试剂盒进行RNA的提取，可在较短时间获得高质量的RNA。电泳检测并与Marker定性对照显示，28S、18S和5sRNA条带清晰，不拖尾(图1)。所提取的RNA经紫外分光光度仪对A值进行检测，A260/A230的比值分别为2.08和2.05，A260/A280的比值分别为1.89和1.76，证明RNA没有DNA等杂质污染。

图1 RNA电泳检测 Figure 1 Electrophoretogram of RNA

1.2 DDRT-PCR引物筛选
本研究选择的锚定引物与随机引物参照Liang等(1994)介绍的方法进行设计，在锚定引物与随机引物的5′端都增加HindⅢ酶切识别位点，锚定引物3′端的2个选择性碱基减为1个，从而将原有12个锚定引物组合减为3个。所有引物序列如表1所示。

表1 mRNA差异显示锚定引物与随机引物序列表 Table 1 Sequences of anchor primers and random primers for mRNA differential display

1.3 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
经1%琼脂糖及6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图2)，各引物组合中有带的引物为锚定引物Za1配合随机引物HAP1、HAP3~HAP12、HAP15、HAP16、HAP18、HAP19、HAP21、HAP23、HAP25~HAP28和HAP34有扩增产物，其中HAP11、HAP23和HAP26 3个引物在花芽中扩增出叶芽中未出现的条带；锚定引物Za2配合随机引物HAP2、HAP5、HAP9~HAP11、HAP17、HAP19、HAP24、HAP30、HAP32和HAP34可扩增出条带，同样在HAP9、HAP10和HAP11中有花芽特异带；锚定引物Za3配合随机引物HAP2、HAP6、HAP7、HAP10~HAP14、HAP17、HAP20~HAP21、HAP23~HAP29、HAP30和HAP33有扩增产物，其中HAP10、HAP12、HAP25和HAP28有花芽特异带。将花芽特异带进行汇总后获得表2所列片段。

图2 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 Figure 2 electrophoretogram by 6% PAGE

表2 回收特异条带表 Table 2 List of special fragments recovered

1.4差异条带的验证和再扩增
通过进行叶芽、花芽扩增条带比较后，将花芽特异条带回收，用相同的引物进行二次PCR验证。所有回收片段均扩增出了条带(图3)，但HAP23、HAP24、HAP26~HAP29各扩增出两条带，不适于进行下一步的实验，而另有13条带因为稳定性差而淘汰。最终获得20个片段用于后续的测序与基因同源性比对分析。

图3 差异片段的重扩增琼脂糖电泳 Figure 3 Re-amplification results of the positive differential fragments

2讨论
目前常用的植物组织RNA提取方法有Trizol试剂法、改良CTAB法等方法(周明芹等, 2008)。在mRNA差异显示分析中对要求RNA的质量要好，特别是不能有DNA污染。本实验中RNA提取采用了Trizol法，尽量缩短Trizol的提取时间，吸取上清时选择上半部的1/2~1/3，避免了DNA的污染，得到了高质量的RNA，并有效消除了PCR扩增过程中DNA的影响。在以往的研究中，如果以总RNA为模板，会产生大量5’端引物间的扩增产物，而选用mRNA为反转录模板就可以避免，并且对后续的反应很有帮助，但是mRNA的提纯所需步骤繁多，而且回收率不高(Sompayrac et al.,1995)。本项研究通过选用Trizol试剂盒，以总RNA为模板，获得了比较清晰的差异条带带，有利于后期的回收利用。

常规的DDRT-PCR反应引物中，3'端分别为A、C、G和A、C、G、T，共有12个组合，可把总mRNA划分为12个亚群，导致对总mRNA的所有差异进行分析的工作量很大。在实际试验中，将锚定引物的3′端由固定两个碱基改为固定一个碱基，从而将引物确定为3种，即5′Ｔ₁₁Ｇ、5′Ｔ₁₁Ａ和5′Ｔ₁₁Ｃ，也减少了每个mRNA反转录反应种类。由于这种简并性避免了部分RNA代表性差的现象，也降低了DDRT-PCR的工作量，提高了谱带的分辨率，增加试验的可重复性(李文雍和陈清轩, 2004)。对于5'端引物的选择，既要考虑GC的含量和mRNA模板的互补序列，也要考虑引物自身的配对，为此Bauer等设计了26个DDRT-PCR专用引物，其共同特点就是A+T与G+C含量近似，3'端以G或C为结尾(Liang et al., 1994)。在本研究中加入了GenHunter公司1996-04提供的8条引物，共形成组合102个，基本可以覆盖所有的mRNA，而研究结果表明，尽管引物组合Za3∕HAP28出现了一条特异片段，但由于重复性差而未进行测序，所有特异片段均来自前26个随机引物。

本研究中获得了清晰、稳定的花芽特异条带，经过验证与重扩增后，对所切取的片段经克隆和测序后，与Genbank中的相关基因比对，获得了10个相似性极高的片段(将另文发表)，说明本试验所选用的锚定引物、随机引物组合及相应的反应体系有利于差异片段的提取，对进一步分析彩色马蹄莲成花基因的提供很好的技术途径。

3材料与方法
3.1试验材料
新西兰引进的彩色马蹄莲品种‘Majestic Red’的新鲜叶芽与花芽。

3.2试验方法
3.2.1总RNA的提取及检测
选择小于0.1克的新鲜叶芽或花芽，放入EP管研磨。在研磨好的植物材料中加入1 mL Trizol试剂，充分混匀，15℃~30℃放置30 min后在4℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液转移至新EP管，每1 mL TRizol加入0.2 mL氯仿，与上清充分混匀。再在4℃条件下以12 000 r/min离心10~15 min，吸取离心液上层400 μL到新管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20~30 min，4℃下10 000 r/min离心10 min，去上清。最后加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，振荡悬浮RNA，然后5 000 r/min离心5 min，倒掉乙醇，洗2遍，室温晾干，然后加入DEPC水30~40 μL，在65℃下溶解RNA 5 min。

取10 μL RNA样品稀释至1 000 μL (DEPC处理的水)，用Varian Cary-100紫外-可见分光光度仪对RNA在260 nm和280 nm处的吸光度(A)进行检测，计算浓度公式为：RNA原液浓度=A260×稀释倍数×40 (ng/μL)，分析提取样品的浓度和质量。

吸取取3 μL的RNA，以1×TAE为缓冲液进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，经EB染色，在凝胶电泳成像系统中观察18S、28S条带，经RNA完整性检测后把合格的RNA存放在-70℃超低温冰箱中备用。

3.2.2逆转录反应
逆转录引物为上游锚定引物[5′-AAGCT11A-3′(HT₁₁A)/5′-AAGCT₁₁C-3′(HT₁₁C)/5′-AAGCT₁₁G-3′(HT₁₁G)]从上海生工生物工程公司购买，根据Reverse transcription system (Promega UsA)的操作说明进行逆转录反应。

3.2.3 PCR扩增程序
差异显示随机引物由上海生工生物工程公司合成。逆转录混合物用前稀释10倍，反应体积为20 μL的反应体系，包括稀释逆转录混合物2 μL，Taq酶1 U，dNTPs 150 μmol/L，随机引物0.4 μmol/L，锚定引物0.4 μmol/L，Mg²⁺ 2.5 mmol/L，2 μL 10×Buffer，选用的反应程序为：94℃预变性2 min后进行94℃变性30 s，再以45℃退火2 min，在72℃下延伸40 s，经40次循环，最后72℃下延伸7 min后在4℃条件下保存。扩增产物先经2%琼脂糖检测，将有带产物用6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离获得差异片段。

3.2.4 6%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳及银染
配制6%聚丙烯酞胺凝胶50 mL (含丙烯酰胺2.85 g, 甲叉丙烯酰胺0.15 g, 尿素21.021 g, 10×TBE 5 mL)，加入30 μL TEMED和300 μL 10%过硫酸胺后，立即混匀，充满玻璃板。室温聚合一小时后，倒入l×TBE缓冲液。

取8 μL PCR扩增产物，加入2 μL6XDNA加样缓冲液混匀后，94℃变性5 min。选用Dyy-6B型稳压稳流电泳仪，上、下槽均加入l×TBE电泳缓冲液，先以1 400 V预电泳30 min，上样后电泳1.5 h，直至溴酚兰离胶底1.5 cm。

电泳完毕后将胶块放入去离子水中漂洗，放入固定液(10%无水乙醇+0.5% HAc)中固定30 min后转入染色液(2% AgNO₃₎中染色2 h，最后用去离子水快速漂洗2~3遍后放入显色液(1.5% NaOH+0.25%甲醛)中显色至条带清晰。放入AlphaImage EP成像系统中拍照记录试验结果，胶用固定液浸泡30 min后再去离子水洗干净晾干保存。

3.2.5差异表达片段的回收和重扩增
经过染色结果对比，把仅仅在花芽样品中出现的特异条带用无水乙醇冲洗后，用干净小刀切取，放在去离子水中漂洗二次，再转入1.5 mL的离心管内，添加30 μL无菌水，在95℃下保温10~20 min，再以8 000 r/min离心3 min，取3 μL上清液进行二次PCR扩增，扩增体系和PCR反应条件和上述DDRT-PCR反应相同。所得到的重扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行扫描分析，最后将产物进行纯化、回收等试验。

作者贡献
杨柳燕和张永春是本研究的实验设计和实验研究的执行人；杨柳燕和许晓岗完成数据分析，论文初稿的写作；汤庚国、孙翊和李宏义参与实验设计，试验结果分析；张永春是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由上海市农委科技兴农重大项目(沪农科攻字2009第2-1号)和上海市科委重点攻关项目(11391901001)资助。特此感谢。感谢同行评审人及编辑对本文成文的评审和修改建议。

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